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中枢性性早熟病人的gpr54活化突变


时间: 2021/6/10 10:00:48 浏览量:16 字号选择: 分享到:

    青春期是复杂的性发育生物学过程,受到遗传、营养、环境和社会经济因素的影响。下丘脑脉冲式gnrh分泌的激活是青春期开始的重要事件。在青春期成熟过程中,下丘脑神经网络是gnrh释放的关键,然后垂体分泌促性腺激素和性腺类固醇生成。

    性早熟定义为在女孩8岁、男孩9岁前出现第二性征。引起性早熟的病因有多种,其中最重要的是区分中枢性(促性腺激素依赖型性早熟)和非促性腺激素依赖型性早熟。中枢性性早熟由下丘脑-垂体-性腺轴过早激活所引起,大多为女孩。而且大部分病例为特发性。但是,已知遗传因素对青春期开始时间具有基础作用,如同相同种族成员以及母亲-女儿、同卵双生子和同胞对有类似的初潮年龄。最近,de vries et al.报告,家族性中枢性性早熟有27.5%的发生率,在这些家庭的分离分析提示了性别依赖性不完全外显率的常染色体显性传递。

    已经提出,吻肽-gpr54信号发放复合体是gnrh神经元和生殖轴青春期激活的?#30475;门人?#65292;在家族性或散发性单纯促性腺激素不足性腺机能减退症已经鉴别出gpr54的功能损失点突变或缺失。此外,gpr-54敲除小鼠有类似的性成熟障碍。在本研究中,我们假设人gpr54受体功能增强点突变可能与gnrh释放过早激活相关,导致中枢性性早熟。

案例报告

    到圣保罗医院发育内分泌科就诊的一名8岁收养女孩。出生后乳房过早发育并缓慢进展,在7岁时乳房发育加速,可见阴毛,病人的病例一般,无神经病学症状;也无其它,例如痤疮、油性皮肤、腋毛和月经等青春期征兆;也无咖啡牛乳色斑。在8岁时,该女孩身高131.5cm、体重26.7kg,无父母身高中值。乳房发育为tanner等级4、阴毛tanner等级2,骨龄11岁(依greulich和pyle法)

    基础黄体生成素(lh)水平小于0.6iu/l(青春期前正常水平<0.6 到 0.7 iu/l),基础促卵泡激素(fsh)为2.6iu/l(青春期前正常水平<1.0 到 7.2 iu/l)。此外,在gnrh刺激后的lh和fsh分别为6.4 iu/l 和5.9 iu/l(青春期后典型的lh水平, >6.9 iu /l),lh/fsh峰值比例1.08。在注射醋酸亮丙瑞林后2小时lh水平为8.5 iu/l (青春期后的典型水平, >10 iu/l)。血清雌二醇水平为22pg/ml(80 pmol/l, 正常青春期前水平, <13 pg/ml [47pmol/l])。

    骨盆超声检查显示无肿块,相对于生活年龄来说卵巢和子宫体积增大(右卵巢4.4m3,左卵巢3.6m3,子宫5.4cm3)。中枢神经系统磁共振成像正常。

    尽管基础lh水平在青春期前正常范围内,gnrh刺激的lh也并非促性腺激素依赖性性早熟诊断数值,无原发性卵巢紊乱或神经性疾病症状支持诊断为特发性中枢性性早熟。因此,开始以gnrh类似物治疗(3.75mg/月醋酸亮丙瑞林),持续4年。中枢性性早熟被满意的治疗反应所证实,包括乳房发育部分消退(到tanner等级3),生长速度下降,骨成熟停滞,卵巢大小下降和促性腺激素的抑制,雌二醇恢复到青春期前水平。在12岁时自发出现初潮,然后有规律的月经。病人的成年身高152.2cm。

方法

dna分析

    医院伦理委员会批准了dna分析方法,由该病人和53名无关的特发性性早熟儿童的父母,以及150名同种族成年对照组得到知情同意书,所有儿童均口头同意。由外周血液白血球提取基因组dna,在自动测序仪上进行gpr54 全编码区域和外显子-内含子边界的扩增分析。

通过定点突变方法产生arg386pro gpr54

    在体外,由定点突变方法生成arg386pro gpr54。使用quikchange ii定点突变试剂盒和含有全长野生人gpr54的哺乳动物表达载体pcmvsport6作为模板。通过直接测序我们证实了突变的存在。

gpr54信号转导研究

    应用geneporter 转染试剂(基因治疗方法),以50ng的野生型 gpr54, arg386pro gpr54或空载体(pcmvsport6)使非洲绿猴肾成纤维细胞(cos-7 细胞)瞬时转染。在增加吻肽(kisspeptin)刺激后,在不同点上测量调解细胞外信号的激酶的肌醇磷酸和磷酸化作用。

结果

dna分析

    病人基因组的gpr54自动测序显示,在外显子5的核苷酸1157位点上鸟嘌呤被胞嘧啶杂合取代,导致受体羧基末端密码子386 (arg386pro)的精氨酸被脯氨酸替代(图1)。arg386pro的突变产生了被smai所识别的限制性酶切位点;在150名青春期发育正常的同种族对照组的300条染色体、53名(女50,男3)无关的特发性中枢性性早熟儿童的106条染色体筛查,均未发现arg386pro的突变。


arg386pro gpr54的功能分析

    在以125i标记的吻肽孵育野生型或arg386pro gpr54转染的cos-7细胞所进行的结合研究显示,氨基酸替代对吻肽的结合亲和力或gpr54表达水平(野生型gpr54的离解常数为4.4nm; arg386pro gpr54为7.0nm;二者的最大结合能力为20nmol/ml蛋白)无显著影响。

    以野生型gpr54、arg386pro gpr54转染的cos-7细胞的基础肌醇磷酸水平无显著性差异。而且剂量反应曲线或野生型gpr54与arg386pro gpr54对吻肽浓度增加(吻肽由10–11到10–7 m)的最大反应不存在显著不同(图2a)。引起野生型gpr54和arg386pro gpr54达到各自基线与最大反应之间一半的反应时,吻肽的浓度分别为0.23和0.28nm,肌醇磷酸的最大活性分别为每分钟每ug蛋白78.4和77.8。时间过程分析表明野生型和arg386pro gpr54在2小时肌醇磷酸水平达到高峰,但此后,以arg386pro gpr54转染的细胞肌醇磷酸水平的下降速度较慢,导致吻肽刺激18小时后显著较高的肌醇磷酸水平(图2b)。当野生型和arg386pro gpr54二者转染入cos-7细胞时,这种效应同样明显。


    为了证实突变受体长时间的作用过程,我们测量了对吻肽刺激反应的另一种gpr45信号转导的下游反应物-细胞外信号转导调解激酶磷酸化的时间过程。在10分钟时所有细胞的细胞外信号转导调节激酶磷酸化达到最高水平,此后水平下降。以arg386pro gpr54转染细胞的磷酸化的细胞外信号转导调节激酶下降速度慢于野生型gpr45转染细胞,在暴露于吻肽60分钟后arg386pro gpr54转染细胞的水平仍然显著较高(图3)。gpr54结合的动力学研究同样说明了吻肽刺激后arg386pro gpr54在细胞浆膜中的存留时间长于野生型。


讨论

    在人类,青春期开始需要下丘脑脉冲式释放gnrh。吻肽-gpr54信号转导复合体似乎是刺激神经系统而激活gnrh分泌。因为间歇性灌注这种蛋白引起大鼠过早的性成熟和猴gnrh过早释放,所以哺乳动物模型确实提示了吻肽的重要作用。

    在本研究中,我们在一名特发性性早熟女孩鉴别出了gpr45的杂合突变,arg386pro。这名女孩在出生时就开时乳房发育,但进展缓慢,提示雌性激素过早的持续轻微增长。根据第二性征逐渐发育、生长和骨成熟度的加速,排除了单纯性乳房初发育。虽然在开始评价病人时gnrh刺激后的lh水平在青春期开始的边缘,但约8%的促性腺激素依赖性性早熟女孩在gnrh刺激后有青春期前的lh水平。本研究中使用gnrh激动剂对性腺轴的作用证实了存在中枢性gnrh轴的激活。在这类收养女孩,分离分析不可行,因为没有其生物学家庭的遗传研究。尽管如此,在种族匹配人群以及美国人和欧洲人群无arg386pro突变,提示arg386pro的突变不是gpr54多态性。

    体外研究显示,在基础条件下转染细胞的arg386pro gpr54与野生型gpr54激活无显著性差异,说明arg386pro突变未产生受体构成性激活。转染gpr54突变、野生型gpr54并以吻肽孵育的细胞、在与吻肽结合的离解常数和剂量-反应曲线上基线与最大反应之间的半数反应、或是对吻肽的最大结合能力或反应也均无差异显著性,说明了gpr54突变与其配体的亲和力以及转染细胞表面上的表达水平未改变。

    然而,在重复时间过程研究中,转染野生型arg386pro gpr54的细胞在吻肽刺激后的肌醇磷酸积累下降的速度慢于野生型转染细胞,因此在长至18小时过程中肌醇磷酸显著较高。同样,细胞外信号转导调节激酶的磷酸化持续时间很长,证实了在对吻肽的反应中通过gpr54突变的细胞内信号转导激活的时间延长。这些结果说明了gpr54突变的减敏速度显著下降。配体结合的动力学研究显示,在吻肽刺激后arg386pro gpr54在细胞表面浆膜上的存留时间长于野生型,提示了突变受体内化或降解速度下降。

    g蛋白耦联受体减敏可通过受体的磷酸化儿发生,通常在羧基末端由细胞内的激酶引起,导致受体与g蛋白和其它细胞内转导通路解耦联。这样的磷酸化可能增强抑制蛋白的结合,启动受体的内化。在非依赖促肾上腺皮质激素的库欣氏综合症病人,报告了类似的减敏损害的受体激活的机制,引起这种激活的是黑皮质素2受体羧基末端突变,黑皮质素2受体是g蛋白耦联受体的一种,影响g蛋白α亚单位gs 而不是gq的信号转导通路。

    仅在少数遗传疾病鉴别出了g蛋白耦联受体功能增强性突变,大部分突变引起受体构成性激活和下游的细胞反应。但是,可能预期gpr54构成激活阻断脉冲式gnrh释放,由此而导致青春期延迟而不是性早熟。对性腺幼稚的猴连续灌注吻肽确实降低了lh水平。与此相反,我们报告了非构成性受体激活模型,其特征为gpr54减敏速度下降。这种机制可能导致细胞反应长时间增强,因此对于吻肽的刺激出现gnrh脉冲振幅增加的释放反应。

    青春期下丘脑吻肽表达增长贡献于生殖轴的成熟。我们推测在arg386pro突变所见的 gpr54减敏下降可能增加了吻肽对gnrh分泌的刺激作用,因此加速生殖轴的成熟。而且本文病人新生儿期的乳房发育可能与吻肽-gpr54系统的新生儿激活一致,类似于特发性促性腺激素不足性腺机能减退男性婴儿由于gpr54功能损失突变而出现的隐睾和小阴茎疾病。

    结论,我们鉴别出了常染色体显性arg386pro gpr54突变,这种突变延长了细胞内gpr54信号转导对吻肽的反应,似乎与中枢性性早熟表型相关。



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